Încă de la începutul episcopatului său, Sfântul Ambrozie intră în legătură cu Sfântul Vasile cel Mare, care era cunoscut şi în Apus, mai ales prin corespondenţa pe care o purta cu Bisericile occidentale din Italia şi Galia şi prin activitatea lui împotriva arianismului. Acest sfânt s-a distins prin lucrarea sa de apărare îndârjită a dreptei credinţe în vremea când arianismul şi alte eresuri bântuiau lumea creştină.
Scrisorile Sfântului Ambrozie către Sfântul Vasile nu s-au păstrat, însă s-a păstrat o scrisoare de răspuns a Sfântului Vasile cel Mare, în care îl felicita pe Sfântul Ambrozie pentru alegerea sa ca episcop al cetăţii Mediolan (Milano de azi) şi în acelaşi timp îl îndemna la păstrarea dreptei credinţe moştenite de la Sfinţii Părinţi. Această scrisoare a însoţit moaştele Sfântului Dionisie, fost episcop de Mediolanum înaintea arianului Auxenţiu, episcop ce l-a precedat în scaun pe Sfântul Ambrozie. Moaştele au fost aduse, la cererea Sfântului Ambrozie, din Cezareea Capadociei unde fusese exilat, la Mediolanum. Din această scrisoare se vede în mod clar atitudinea de apărare a credinţei niceene în faţa atacurilor ariene, încă din primele luni ale episcopatului Sfântului Ambrozie, atitudine întărită de cererea moaştelor Sfântului Dionisie.
Scaunul episcopal de la Mediolanum
Importanţa scaunului episcopal de Mediolanum îi permitea supravegherea vieţii religioase şi din Ilyricul Occidental. În anul 376, trecând la cele veşnice episcopul Germinius de Sirmium, se impunea alegerea unui episcop ortodox, întrucât poziţia oficială a curţii imperiale, reprezentată de împărăteasa Iustina, era de a susţine alegerea unui episcop arian. Pentru a se evita alegerea unui episcop arian şi a se asigura astfel alegerea în linişte a ierarhului ortodox Anemius, Sfântul Ambrozie s-a dus la Sirmium. La hirotonia întru arhiereu a lui Anemius a slujit însuşi Sfântul Ambrozie, împreună cu alţi ierarhi ortodocşi.
Doi ani mai târziu, Sfântul Ambrozie a mers din nou la Sirmium pentru a pregăti, împreună cu episcopul Anemius, Sinodul care a avut loc în iulie 378. Tot aici s-a întâlnit cu împăratul Graţian, care dorea să se informeze şi el asupra arianismului. Sinodul ortodox de la Sirmium din iulie 378 a urmărit nu numai nimicirea ultimelor resturi ariene în provinciile romane sud-dunărene ale Imperiului Roman, ci şi combaterea ereziei macedonienilor, care negau dumnezeirea Sfântului Duh şi consubstanţialitatea Lui cu Tatăl şi cu Fiul.
Împăratul Graţian a publicat un edict de toleranţă, prin care a lăsat fiecăruia libertatea să urmeze religia dorită, cu excepţia maniheilor, a eunomienilor, a arienilor extremişti şi a fotinienilor, continuatorii doctrinei ereziarhului Fotin de Sirmium. Actul de toleranţă al împăratului Graţian nu a durat mult căci printr-un nou edict, publicat la 3 august 379, Graţian a anulat prevederile edictului din 378 de la Sirmium. La 22 aprilie 380, Graţian a semnat, în drum spre Mediolanum, un nou edict, prin care a reînnoit interzicerea ereziei ariene şi a ordonat închiderea şi confiscarea lăcaşurilor de cult ale ereticilor arieni.
Este sigur că noua orientare a împăratului Graţian se datoreşte influenţei Sfântului Ambrozie care a scris în 378, răspunzând dorinţei împăratului, primele două cărţi din lucrarea "Despre credinţă", pe care a completat-o în 380 cu alte trei cărţi, iar în 381, lucrarea "Despre Sfântul Duh", în care combate erezia pnevmatomahilor.
Sinodul de la Aquileia
Începând cu luna martie 381, împăratul Graţian şi-a stabilit reşedinţa la Mediolanum. Se proiecta atunci convocarea unui sinod al întregii creştinătăţi. Episcopul Mediolanului a reuşit să convingă pe împăratul Graţian să modifice planul convocării unui sinod, la care ar fi trebuit să participe episcopii întregii Biserici atât din Răsărit, cât şi din Apus. Scrisoarea sinodală Binecuvântat fie Dumnezeu, redactată la sfârşitul Sinodului de la Aquileia, oferă unele informaţii despre aceste lucruri. Pentru judecarea episcopilor eretici, Palladius şi Secundian, se spune în scrisoarea sinodală, "din pricina cărora romanii din cele mai îndepărtate părţi ale lumii cereau să se adune sinodul. Iată că nici unul, fie el chiar încărcat de anii bătrâneţii, respectabil prin părul său alb, nu a pregetat să vină" .
Rescriptul împăratului Graţian, pentru convocarea Sinodului din Aquileia, adresat prefectului pretoriului Syagrius, citit la deschiderea sesiunii Sinodului, în ziua de 3 septembrie 381, de diaconul Sabinian, a fost redactat cu ocazia Paştilor din acel an, în urma unei întrevederi a împăratului Graţian cu Sfântul Ambrozie. Prin acest rescript, Graţian a făcut cunoscut episcopilor Bisericii că Sinodul de la Aquileia e convocat pentru ca ei să nu se mai certe cu privire la dogme şi învăţătura Bisericii, ci să rezolve între ei orice neînţelegere doctrinară. Sinodul italo-ilyrian din Aquileia s-a deschis oficial la 3 septembrie 381, participând 35 de delegaţi, în majoritatea lor episcopi. A prezidat episcopul locului, Valerian, asistat de Sfântul Ambrozie şi Eusebiu de Bolonia. Conducerea efectivă a dezbaterilor a avut-o Sfântul Ambrozie. Cei doi episcopi arieni, Palladius şi Secundian, au fost anatematizaţi, împreună cu preotul arian Attalos din Noric.
Din Imperiul Roman de Răsărit nu a venit la Sinodul din Aquileia nici un episcop, întrucât episcopii orientali şi cei din dioceza Tracia şi Ilyricul răsăritean participau la Sinodul II Ecumenic, convocat de împăratul Teodosie cel Mare, care s-a ţinut la Constantinopol în primăvara şi vara anului 381.
Împărăteasa Iustina, protectoare a arienilor
Deşi prin sinoadele de la Constantinopol şi Aquileia s-a pus capăt ereziei ariene, Sfântul Ambrozie s-a confruntat şi după această dată cu reprezentanţi sau susţinători ai arianismului. El a trebuit să protesteze faţă de decizia împărătesei Iustina de a pune la dispoziţia arienilor o biserică din afara zidurilor oraşului (Teodoret de Cir, "Istoria bisericească").
Chemat să trateze cedarea bisericii în primăvara anului 385, Sfântul Ambrozie a fost susţinut de populaţia oraşului aflată în faţa palatului imperial. Umilinţa suferită de împărăteasa Iustina fusese prea mare pentru ca aceasta să fie dispusă să o uite. La începutul anului 386, i s-a cerut Sfântului Ambrozie să predea biserica mare din Mediolanum episcopului Mercurinus. Credincioşii împreună cu Sfântul Ambrozie au refuzat să elibereze biserica şi să o cedeze arienilor. Atunci, pentru a-i încuraja pe creştinii aflaţi în apărarea propriei biserici şi, în acelaşi timp, pentru a confirma dreapta credinţă, Sfântul Ambrozie a compus câteva imnuri, în metru foarte simplu şi uşor de cântat.
Între anii 381 şi 382, Sfântul Ambrozie scrie lucrarea "Despre Taina Întrupării Domnului", îndreptată împotriva ereziei hristologice a lui Apolinarie. Toate aceste fapte dovedesc că Sfântul Ambrozie s-a ostenit necontenit pentru ocrotirea unităţii şi păcii în Ortodoxie şi pentru păstrarea neştirbită a dreptei credinţe în Apus, aşa cum se mărturiseşte şi într-un condac din Acatistul Sfântului Ambrozie, unde este numit "stea de Dumnezeu trimisă asupra pământului Bisericii", care a alungat "cu lumina învăţăturii şi a vieţii sale ceaţa eresurilor".
Preţuit de Sfântul Vasile cel Mare
Din anul 374 până în anul 397, Sfântul Ambrozie (339-397) a fost episcop al cetăţii Mediolanum. În toată această perioadă, autoritatea sa în Biserica Apuseană a crescut progresiv, atrăgând totodată după sine o considerabilă influenţă în domeniul Statului. Era recunoscut ca Sfânt Părinte, încă din timpul vieţii şi chiar personalităţi răsăritene, precum Ascholius al Tesalonicului sau Sfântul Vasile cel Mare, i-au arătat o preţuire deosebită.
